長期以來， 殺菌劑被用來給創口消毒殺菌。

但是小組在前線的研究發現，殺菌劑殺死病毒的同時，也殺死了人體的正常細胞，很可能對治療起到反作用，使得傷口感染更加嚴重。

經過試驗，他們建議使用濃鹽水對創口殺菌，而且越早處理效果才有效果。可惜，當時這一提議並未引起重視。

二戰時，濃鹽水消毒殺菌才被廣泛應用，挽救了許多戰士的生命。弗萊明的許多研究在前線得到驗證， 也因此弗萊明在醫學界逐漸嶄露頭角。

發現青霉素，偶然在必然中孕育

回國後，弗萊明專心研究能殺死葡萄球菌的方法，以幫助傷患降低感染幾率。弗萊明有一個實驗習慣，不論是哪種培養基，都會長久放置後，再進行觀察，沒有有用的發現後才去清洗乾淨。

在培養一種新的黃色球菌的時候，弗萊明重感冒還未痊癒， 打了個噴嚏，他突發奇想取了自己一滴 鼻腔液放在了培養基上。

兩個星期後，弗萊明觀察發現培養基上遍佈球菌的克隆群落，鼻腔黏液所在位置卻沒有，而且其稍遠位置有一種半透明的玻璃狀新克隆群落。但是進一步的研究發現，這其實只是細菌融化所致。

1921年，弗萊明開始抗菌素的研究， 實驗結果表明鼻腔黏液中含有抗菌素。他認為這種抗菌素是一種酶，而且幾乎存在於人體的大部分體液和分泌物中。

賴特建議把這種酶命名為 「溶菌酶」。

接下來的七年，弗萊明帶領他的研究小組深入研究落菌酶的作用，但是收效甚微，他們失望地發現它的殺菌能力不強，對多種病原菌都沒有作用，於是放棄了研究。

1927年，弗萊明看到了一篇關於最新金葡菌(醫院內導致交叉感染的主要致病菌)變異的研究文獻，並產生了濃厚的興趣，決定重複該實驗。

他在培養基邊緣發現了一塊因溶菌而顯示的慘白色，這就是青霉素。

實驗表明，它的分泌物可以殺死某些葡萄球菌，這這些葡萄球菌容易引起創口感染。

弗萊明將青霉素粗提物用在家兔和小白鼠身上，證實了他的結論。弗萊明的追隨者們，在一些深受感染危害的患者上使用過青霉素粗提物，並且取得了良好的效果。

但是在大量實驗過程中， 弗萊明發現葡萄球菌遇到青霉素，會很快產生抗性。而且在天竺鼠身上試驗時，致死率非常高。弗萊明不得不非常慎重使用青霉素。粗提物成品裡含有太多雜質，必須提純後才能用於人員傷口治療。

由於當時的技術條件限制，弗萊明很難提取高純度的青霉素，更別提應用於臨床治療，他最終放棄了青霉素的繼續研究。